自20世纪50年月以来，研究职员一直使用由华莱士·考尔特（Wallace Coulter）发明的著名要领“流式细胞术”（flow cytometry）来表征免疫细胞的差别类型，这种要领普遍应用于研究和人体血样剖析。这一要领使我们能够更深入地相识免疫细胞的生长，并提供了评估人体康健和诊断种种血液癌症的新途径。厥后，流式细胞术也被应用于其他细胞类型。
在古板的流式细胞术中，细胞外貌和细胞内的卵白质是通过与荧光探针相连的抗体分子来检测的。然而，只管这种要领具有单细胞迅速度，但它在检测多种卵白质时受到限制，由于在荧光光谱规模内能够清晰区分的荧光染料数目有限。
2009年，“质谱细胞术”（mass cytometry）的泛起使得能够同时定量丈量单细胞中50种卵白质，并对细胞的身份和心理状态举行更细腻的剖析。在质谱细胞术中，抗体与非放射性金属同位素相连。这些同位素可以通过质谱仪的差别通道凭证其质量举行量化。然而，与流式细胞术和荧鲜明微镜相比，质谱细胞术及其姊妹手艺“图像质谱细胞术”（IMC），即用于可视化完整组织切片中的细胞卵白质，保存迅速度降低的问题。
现在，经由15年的研究，由哈佛大学Wyss研究所向导的一个研究相助团队，包括来自麻省理工学院和多伦多大学的研究职员，开发了一种使用DNA纳米手艺显著提高质谱细胞术和IMC迅速度的要领。通过将一种名为“循环扩增”（Amplification by Cyclic Extension，ACE）的新信号放大手艺应用于与抗体毗连的DNA条形码，他们能够将抗体连系的金属同位素爆发的卵白质信号放大凌驾500倍，并同时以高迅速度检测30种差别的卵白质。
这种新要领使他们能够定量检测有数卵白质，研究重大的生物组织转变，以及研究调理免疫细胞功效的整个卵白质网络怎样对刺激和病理条件做出反应。在IMC应用中，ACE还使得在组织学切片中识别细胞类型和组织区室成为可能，并研究与多囊肾病病理相关的组织结构转变。这些发明已揭晓于《自然生物手艺》（Nature Biotechnology）上。
“ACE资助填补了细胞计量剖析中的一个要害空缺：通过提高质谱细胞术的迅速度，它使得单细胞剖析平台同时实现高迅速度、高多重化和高通量。它为以高度多重化和迅速的方法视察悬浮和完整组织中的单细胞提供了更多时机，这可以更深入地明确正常和病理的生物历程，”研究向导者、Wyss研究所焦点成员彭寅（Peng Yin）博士说道。彭博士照旧哈佛医学院系统生物学系的教授。
更多DNA、更多金属同位素、更高迅速度
图片信息：ACE手艺能够实现高度复用和敏感的信号放大，以检测单细胞中的卵白质，使用悬浮液细胞计数和成像细胞计数剖析。该图显示了组织切片中单个细胞中的卵白质怎样通过与ace增强抗体连系来定量。泉源：Su Min Suh/SciStories。
此前，彭博士和Wyss研究所的团队开发了多种DNA驱动的成像手艺，这些手艺可以在单分子水平上展现细胞的内部事情机制，或通过在单个组织切片中可视化多种差别的RNA和卵白质分子。然而，这些要领所建设的DNA结构不敷结实，无法遭受质谱细胞术中使用的相对苛刻的条件。
“ACE通过允许研究职员将抗体分子与比古板质谱细胞术更多的金属同位素连系，解决了质谱细胞术目今的迅速度问题。这大大增进了对普遍的低品貌卵白质的量化，这在以往的单细胞要领中一直是一个挑战，”配合第一作者、彭博士团队的博士后研究员吕晓康（Xiao-Kang Lun）博士说道。吕博士与配合第一作者、ACE其他应用的开发者、彭博士团队的博士后研究员盛宽伟（Kuanwei Sheng）博士相助。盛博士体现：“受到我们之前对引物扩增反应（用于建设线性DNA串联体）和PCR反应（通过同步的热循环实现扩增）事情的启发，我们发明了ACE，通过热循环在受控的方法下原位合成线性串联体。”
ACE建设了一个具有多个连系位点的框架，用于短的金属同位素载体“检测链”。别的，通太过支合成框架链，研究职员进一步提高了检测有数卵白质的迅速度。线性ACE平均提供13倍的信号放大，而分支ACE则使得最初未放大的信号增添凌驾500倍。为了在质谱细胞术剖析历程中稳固整个ACE序列复合物并坚持其完整性，他们用化学交联剂将框架链与添加的检测链之间形成的短双链交联在一起。盛博士增补道：“凭证这个计划，我们设计了一个具有33种可区分（同源）ACE序列的面板，这些序列的合成不会相互滋扰，并将其应用于三种完全差别的剖析类型。”
ACE的应用
图片信息：这个插图诠释了怎样使用ACE来建设包括多个相同的非放射性金属同位素的结构（上框）。该团队设计了合成抗体上33种差别ACE结构的蓝图，以实现悬浮细胞术和成像细胞术剖析中卵白质的多路和高迅速度检测。泉源：哈佛大学威斯研究所。
团队首先使用ACE研究上皮细胞向间质细胞的过渡及其逆转。上皮－间质过渡（EMTs）和间质－上皮过渡（METs）爆发在胚胎发育历程中，但前者尤其在肿瘤变得侵袭性和转移性时也会重演。通过对小鼠乳腺癌细胞在28天过渡历程中，从上皮状态转变为间质状态再返回的多个时间点，剖析总共32种上皮和间质标记物、信号分子以及有数转录因子，并对效果举行盘算剖析，他们展现了这两个历程的新看法。盛博士说道：“ACE使我们能够在单个细胞中同时对低品貌转录因子的水平举行剖析，并连系反应细胞心理和信号状态的标记物。这提供了一个更细腻的图景，展现了怎样通过增添和镌汰要害转录因子（包括Zeb-1和Snail/Slug）来驱动EMT和MET中的分子程序。”
在第二个例子中，他们深入研究了单个T细胞的内部机制。T细胞外貌TCR分子的刺激会激活一个重大的细胞内信号卵白网络。在单细胞区分率下剖析这些信号响应很是难题，部分缘故原由是T细胞的体积较小。网络中的个体卵白质通过其他网络卵白（通常称为激酶）附加的磷酸残基被激活。这些激活的网络卵白会进一步磷酸化其他网络卵白，最终导致T细胞行为的转变，例如对病原体或癌细胞的反应。研究职员将ACE应用于一个包括30种特异性连系于TCR网络卵白中磷酸化位点的抗体面板，该面板具有在应激、炎症、细胞增殖和其他反应中的功效。“通过ACE增强的质谱细胞术剖析，我们捕获到动态转变的TCR网络在单个原代人类T细胞中的定量快照。这使我们能够研究T细胞激活事务的时间和一连性的单细胞差别，并展现怎样通过外部信号激活网络从其基础状态最先，”吕博士体现。
团队还使用相同的ACE增强抗体面板视察了“损伤诱导的T细胞麻木”征象。T细胞在情形中履历损伤（例如，重大手术中的组织损伤）时，往往会变得免疫抑制。为了最先明确TCR网络怎样导致这种征象，彭博士团队与配相助者、麻省理工学院生物学与生物工程学David H. Koch教授迈克尔·雅费（Michael Yaffe）博士相助。雅费博士对组织损伤周围的微情形怎样抑制免疫系统很是感兴趣，并提供了从接受手术的患者那里获得的“术后引流液”样本。通过刺激T细胞与术后引流液及其TCR，研究职员能够隔离导致单个T细胞阻止破碎并变得疲劳的特定网络转变。
最后，他们还研究了ACE在组织切片空间剖析中的应用，重点关注人类肾脏。由于强自觉荧光，肾脏组织很难通过荧鲜明微镜剖析，而古板IMC的迅速度也缺乏。研究职员开发了一个包括20种ACE增强抗体的面板，用于种种肾脏标记物，并将其应用于来自多囊肾病患者的肾皮质切片。与配相助者、多伦多大学的Hartland Jackson博士（专注于多重成像手艺）的相助使他们能够识别差别的细胞类型及其在肾脏近曲小管、远曲小管、荟萃管和血液过滤肾小球中的组织。吕博士体现：“我们发明了细胞和组织的新病理特征，并发明与肾脏疾病相关的干细胞标记物Nestin在肾小球中体现出很是不匀称的表达。这可能意味着组织的差别部分可能同时履历差别的病理阶段。”
“彭寅团队及其相助同伴开发的这一新型质谱细胞术要领再次展示了使用DNA纳米手艺提升现有手艺的实力，将其带到更高的迅速度和特异性水平。这种相对简朴的要领将为细胞、组织和器官功效的全新看法提供可能，无论是在康健照旧疾病时代，”配合资深作者、Wyss研究所首创主任、哈佛医学院及波士顿儿童医院的血管生物学Judah Folkman教授Donald Ingber博士说道。他还担当哈佛大学John A. Paulson工程与应用科学学院的Hansjörg Wyss生物启发工程教授。
杂志：Nature Biotechnology
DOI：10.1038/s41587-024-02316-x
