“RNA天下”假说提出 ，地球上最早的生命可能是基于RNA的——一种单链分子 ，类似于DNA ，并且与某些现代病毒有相似之处。这是由于 ，像DNA一样 ，RNA可以携带遗传信息 ，但像卵白质一样 ，它还可以作为催化剂 ，增进或加速化学反应。虽然已有一些RNA催化剂（即核糖酶）的活性获得了验证 ，但盘算展望批注 ，成千上万种其他RNA催化剂可能保存于从细菌到植物、动物等种种生物体中。
最近揭晓于《Nucleic Acids Research》杂志上的研究中 ，宾夕法尼亚州大学的研究职员开发出一种新要领 ，即高通量剪切检测或CHiTA ，其可以在一次实验中测试这些展望的核糖酶的活性。
研究团队测试了2600多种差别的RNA序列 ，这些序列被展望属于一种叫作“Twister核糖酶”的种别 ，这类RNA酶能够将自身剪切成两部分。约莫94%的核糖酶在实验中体现出活性 ，研究还发明 ，这些核糖酶即便在结构上保存细微缺陷 ，仍能坚持其功效。别的 ，研究团队还首次在哺乳动物的基因组中发明了一种Twister核糖酶 ，特殊是在瓶鼻海豚的基因组中。
“DNA是双链分子 ，通常形成简朴的螺旋结构 ，而RNA是单链的 ，可以折叠成多种差别的结构 ，包括环状、膨胀区和螺旋 ，”宾夕法尼亚州大学Eberly科学学院化学系、生物化学与分子生物学系的优异教授、研究团队认真人Phil Bevilacqua体现。“RNA催化剂的功效依赖于这些结构 ，它们被分为几类。我们选择专注于所谓的‘Twister核糖酶’ ，由于它们的一项特征是能够将自身剪切成两部分 ，这一历程可以通太过析其基因序列视察到。”
图片链接：https://www.eurekalert.org/multimedia/1048109
图片信息：宾夕法尼亚州立大学开发的新型切割高通量测定 （CHiTA） 提供了一种无疤痕要领 ，可在单个实验中表征数千种差别的小自裂解 RNA 酶 ，称为 twister 核酶。该图显示了一些经由测试的核酶的 2D 模子 ，这些核酶的螺旋和环元件有缺陷 ，但仍然活跃 ，这批注 twister 核酶的自裂解能力可以容忍这些稍微的结构缺陷。
在这项研究之前 ，约有1600种Twister核糖酶凭证基因组序列和结构展望被提出 ，但其中只有少数几种经由实验验证。他们还通过仔细手工搜索围绕一个短的、高度守旧的序列的基因组配景 ，还发明了约莫1000种特另外Twister核糖酶候选序 ，该序列是 1,000 个生物体基因组中许多核酶所共有的。
CHiTA依赖于两个要害手艺。其一是近年来开发的“平行大规模寡核苷酸合成”（MPOS）手艺。这项手艺使得研究团队能够设计并购置成千上万种差别的核糖酶序列 ，并将它们合成成小片断DNA ，所有这些序列可以在统一个试管中举行实验。他们设计的每个序列都以其中一个2,600种展望的核糖酶序列为焦点 ，再在两头附加短DNA片断 ，资助他们复制DNA并转录成RNA举行活性测试。
图片信息：研究摘要。
“通过MPOS ，我们只需建设一个包括我们感兴趣的序列的电子表格 ，发送给供应商 ，之后他们会把每种序列的小量样本寄给我们 ，”研究的首位作者、宾夕法尼亚大学博士生Lauren McKinley诠释道。“关于CHiTA ，我们需要大宗的每种序列 ，因此我们会在每个序列的两头添加DNA片断 ，以便通过PCR手艺制作大宗拷贝。但这些特另外DNA片断可能会影响我们测试核糖酶功效的准确性。”
CHiTA的第二个要害手艺是通过“限制酶”卵白往复除这些附加的DNA片断。限制酶能够在特定的短序列（称为识别位点）处切割DNA。然而 ，大大都限制酶在识别位点的中心切割DNA ，导致切割后的DNA片断仍带有部分识别位点序列 ，这可能影响核糖酶的结构和功效。
“我们发明了一种限制酶 ，它能在识别位点周围稍远的地方切割DNA ，这样就能确保设计的序列在切割后不会留下多余的DNA片断 ，”McKinley说道。“这样 ，我们就可以确保测试的正是核糖酶的准确序列。”
在实验中 ，研究团队首先通过MPOS订购的序枚举行扩增 ，使用限制酶去除任何附加的DNA片断 ，然后将DNA转录成RNA。若是某个序列编码的是活性核糖酶 ，当RNA合成后 ，它会迅速折叠乐成能性结构并自我剪切。研究职员随后可以网络RNA并将其转化为cDNA（互补DNA） ，然后举行测序 ，以确定RNA是否已被剪切 ，或者是否仍为完整序列。
“我们对cDNA举行测序时 ，可以看到有几多RNA已经被剪切 ，这作为核糖酶活性的一个标记 ，”McKinley诠释道。“在我们测试的序列中 ，约94%体现出显着的RNA剪切。现实上 ，每个活性核糖酶的剪切比例与之前单独测试的核糖酶效果相似。”
接着 ，研究团队检查了这些测试序列的展望结构 ，发明其中许多序列与经典的Twister核糖酶结构相比 ，保存一些稍微的转变或缺陷 ，但它们依然能够自我剪切。这批注 ，核糖酶的功效对结构上的细微转变有较高的容忍度 ，纵然结构不完善 ，它们依然能够正常施展作用。
这一结构容忍度提醒 ，可能保存更多未被发明的Twister核糖酶 ，它们不切合最初搜索的标准。事实上 ，基于这项研究中新发明的序列形貌 ，研究团队在瓶鼻海豚的基因组中首次发明了哺乳动物的Twister核糖酶。
“相识这些核糖酶在序列和结构上的容忍度将资助我们设计新的、更有用的核糖酶识别要领 ，”Bevilacqua教授体现。“我们现在对核糖酶功效的相识大多依赖于化学原理 ，而它们在生物学中的作用仍然是我们正在探索的领域。能够在像CHiTA这样的大规模实验中测试核糖酶的活性 ，将有助于加速我们发明新核糖酶的历程 ，并更深入地明确它们在细胞中的作用。这也将资助我们追溯早期地球生命的起源 ，探索RNA在生命起源中可能施展的要害作用。”
杂志：Nucleic Acids Research
DOI：10.1093/nar/gkae908
